流式細胞技術之進展—多重螢光之應用

因為流式細胞儀已經進展到可以偵測六種、八種或是更多的螢光顏色，新的染劑以及抗體螢光染劑結合種類也與時俱進；可是，傳統上，隨機選擇抗體與螢光染劑結合的方式，並無法得到最佳的實驗結果；在前人的實驗經驗中，我們可以從而得到智慧並避免重覆犯錯；所以，這篇文章希望可以提供螢光試劑組合的簡單規則，進而協助研究者得以順利進行多重螢光染色的流式細胞實驗。

The Basics：Know your instrument

試劑的選擇應該根據你所使用的儀器機型而決定：激光及偵測器的數量決定了螢光染劑是否可以被激發，以及是否有足夠的偵測器來接收螢光染劑的組合數目；儀器光學系統的設計以及儀器設定如光電倍增管的電壓都會影響螢光染劑的偵測效率(See the BD Application Note, Establishing Optimum Baseline PMT Gains to Maximize Resolution on BD Biosciences Digital Flow Cytometers, bdbiosciences.com/baselineoptimization)；最後，光學濾鏡的選擇也會大大地影響螢光染劑被偵測到的亮度，你可以想像光學濾鏡的選擇就像是一個付出與接受的行為，當你選波長較寬的帶通濾鏡(Band pass filter)，你可以獲得較多某一特定螢光染劑的訊號，但是同時你也會得到較多來自於鄰近波長的螢光染劑訊號，下述網址提供一個虛擬測試，讓你可以瞭解到上述的現象 (bdbiosciences.com/spectra) 。

Fluochromes：Go for the bright…

在現有各種不同的儀器規格中，很難設定某一”最佳”螢光染劑組合，而可以套用在所有的儀器上；然而，如果使用者僅考慮特定的機型，如BD^TM LSR II，就所有染劑依其表現的”亮度”來排序是可行的 (當激光配備與光學濾鏡的組合固定)；但是，如何定義所謂的”亮度”? 一個好的”亮度”定義應該開始於”解析度”的計算，就是區別弱陽性訊號與背景訊號的能力。在特定偵測器中的背景訊號，主要是由電子雜訊、細胞自體螢光以及從其他螢光染劑產生的干擾訊號(Spillover)所組成；上述的雜訊或是干擾訊號越多，背景訊號的分佈寬度 ”W” (或是標準差，SD) 也就越大；因此，Stain Index可以作為解析度測量方式，

其公式如下：Stain Index = D/W，

D代表陽性分佈與陰性分佈平均值的差；W代表陰性分佈標準差的二倍，如圖一所示。

當同樣的抗體結合不同的染劑，研究者可以比較其Stain Index來瞭解染劑相對的亮度；以此為例，Table 1顯現出在BD LSR II標準規格的機型中，針對CD4抗體結合螢光染劑的Stain Index；從這個比較表中，研究者可以瞭解在此機型中，不同螢光染劑相對的亮度；由此，可以建立選擇螢光試劑的第一原則：挑選可以選擇染劑中，亮度最亮的螢光染劑；舉例來說，如果你現在已經有四色組合：FITC、PE、PerCP及APC，而你想要加入第五個螢光染劑，以表一為例，PE-Cy5是你最佳第五色選擇；因其Stain Index是在你的四色組合外，最高的一個。

But minimize spillover

螢光染劑的訊號分布相當寬廣；在比較表一中，試劑是單獨染色，進而偵測其訊號 (並非將所有試劑一起測試)；當其他試劑一併加入染色且偵測其訊號的同時，光譜重疊(Spectral overlap)或是螢光溢散(Spillover)就會成為問題；簡單地說，越多螢光參數需要被分辨時，也就有越多螢光訊號間互相干擾的問題需要被解決。

處理螢光溢散的方法是使用所謂的 ”光學補償”(Compensation)；舉例而言，這個校正方法是讓PE的訊號出現PE的接受器中，而不受到其他螢光訊號如FITC的干擾；個別細胞訊號會高於或低於平均值，而形成一個分佈，這個校正是以平均數來計算；光學重疊越多，帶入的雜訊也就越多，也使得訊號分佈越廣；不幸的是，光學補償並無法完全移除這些雜訊的產生，因為受到其他螢光訊號的干擾，訊號分佈隨著變寬，訊號間的解析度- Stain Index也隨著變小；所以，螢光試劑選擇的第二規則是：當選擇試劑組合時，應盡可能減少試劑間光譜重疊的可能性；此一原則可能會與第一原則相互抵觸，舉例而言，在比較表一中，PE-Cy5的Stain Index很高，但是其溢散到APC偵測範圍也非常寬，雖然研究者可以同時使用這兩種染劑組合進行染色，但是APC的Stain Index相對於使用其他試劑組合，如PerCP-Cy5.5與APC而言，將會大幅減少；這是一個例子說明：

有時我們必需捨棄一些亮度較亮的染劑，以避免光譜溢散的影響(也就是避免解析度下降的影響)。

Colors and specificities：Define winning combinations

綜合上述兩個原則，研究者可以選出適當的染劑組合來進行六色、八色或更多螢光參數的實驗，如表二；這些組合是根據BD流式細胞儀機型：BD LSRII、BD FACSAria^TM cell sorter、BD FACSCanto^TM flow cytomter以及市售常見並易獲得的螢光染劑抗體組合而作的選擇，一旦染劑組合確定後，研究者可以根據所需的抗體與染劑一一對應，換言之，研究者可以根據既有市售的抗體-染劑組合加以選擇；而在此選擇中，亮度及光譜溢散仍是選擇重要依據；下述案例將逐一詳加解釋：想像你要研究在CD8⁺T細胞中CD62L的表現，CD8是一個表現量大的蛋白質，因此螢光抗體染色會呈現很亮的結果；相對於CD8的染色結果，CD62L表現會較為”不亮”(dim) (因為CD62L在細胞表面的表現量較少，或是抗體與CD62L結合的親和力較低)，所以你可能會選擇較亮的螢光染劑來搭配CD62L抗體，如PE，而選擇較為不亮的螢光染劑來搭配CD8，如FITC；但是FITC會有相當多的訊號會溢散到PE偵測區(如圖二所示)，結果是，CD8⁺T細胞會被大量FITC抗體染上，而PE接收區的訊號則被干擾而產生較寬的背景訊號，也就是CD62L抗體染色的解析度並不是處於最佳狀態；

數個方案可以改善此一狀態：

1)      選擇CD8搭配比較不會干擾PE偵測區的螢光染劑，如PerCP-Cy5.5或是APC。

2)      將CD62L抗體搭配較亮的螢光染劑，但不會受到FITC的干擾，如APC或PE-Cy5

請注意在這個例子中，僅有CD8⁺細胞結合上大量螢光-抗體，也就是說，只有CD8⁺細胞的訊號會干擾PE偵測區的現象，如果研究者有興趣的是CD4⁺T細胞上CD62L的表現，則此一組合(CD8 FITC、CD62LPE)也可以被接受而使用。

所以，在這個例子中，我們可以發現另外兩條對於螢光試劑選擇的原則：將最亮的螢光染劑配給結合量較少的抗體，以此類推；但同時避免強陽性細胞對於需要較佳解析度偵測訊號的干擾。

Tandem dyes：Watch out for degradation

最後，應納入考慮的是Tandem dye的衰減；APC-PerCP及PE-Cy7可能因為曝露在光線、固定液或是因為温度的升高而衰減螢光量；因而使得溢散在Parent dye，如APC或PE的偵測區的訊號增加；這現象開始時，會發現有少量細胞群會在APC或PE偵測區產生假陽性族群；減少使樣本曝露於光線、熱或是以甲醛為主的固定液，可以避免此一影響；某些實驗無法避免上述會對Tandem dye造成影響的因素，此時必需考慮是否會影響到APC或PE訊號的解析度；如果影響的結果無法被接受，應該採用不同的試劑組合或使用替代實驗步驟。舉例來說，某些情況必需對細胞進行固定後，才能進一步收集數據，像是針對具有生物感染性的樣本；此時可以使用某些可以穩定APC-Cy7的固定液來替代甲醛(BD Biosciences Cat. No. 338036)。

Control to validate your panel

在考慮完上述因素之後，便可以開始測試多色試劑組合；在此之前，有兩種對照組研究者可以在起始設定中加入分析：Fidelity control及Fluorescence-minus-one (FMO) control；Fidelity control是指使用單一抗體(或是同時加入用於作為圈選使用的抗體) 與加入全部抗體之後的比較；在這個比較中，研究者可以瞭解加入其他抗體後，是否會對特定抗體的解析度造成影響；FMO control也可以在沒有適當陰性對照存在的情況下，作為圈選的依據；一般來說，一旦試劑組合選定之後，上述對照組並不需要每次都做一遍。

總結上述對於應用於多色流式細胞實驗的試劑選擇原則，列出下列五點原則，其中有些原則或許會互相抵觸，需要研究者進一步平衡所需，以獲取最佳實驗結果。

Rule 1. 針對所使用的儀器規格，挑選最亮的螢光染劑組合。

Rule 2. 挑選螢光染劑，使其互相間光學重疊最少。

Rule 3. 最亮的螢光配合抗原表現量較少的抗體，以此類推。

Rule 4. 避免抗原表現量多的細胞訊號，因為光譜溢散而影響到需要高解析度的待偵測細胞群。

Rule 5. 採取步驟以避免Tandem dye的衰減，並注意其衰減對於實驗數據的影響。

隨著文獻發表或是由廠商建議的多色組合越來越多，將可使研究者免去一開始逐一測試螢光染劑的辛勞；但是，多色流式細胞實驗有其多樣性，需要研究者挑選最佳試劑組合以期得到最佳實驗數據；期待本文可以提供研究有用的訊息。(資料來源：美商必帝股份有限公司台灣分公司)

References

1. Maecker HT, Frey T, Nomura LE, and Trotter J. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry A. 2004;62:169.

2. Baumgarth N and Roederer M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 2000;243:77.

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流式細胞技術之進展—多重螢光之應用

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