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雷射共軛焦顯微鏡觀察系統在奈米藥物載體之應用
林宥欣
中國醫藥大學 生物科技系
藥物是希望能醫治疾病、減低患者痛苦和降低治病的風險等為目的，隨著藥物篩選和蛋白質體的技術成熟下，目前已陸續出現具相當療效的藥物和疫苗，隨著眾多藥物的開發，需發展出一可保護藥物可免受破壞或提升藥物療效的生物製劑為導向。奈米科技是根據材料在奈米尺寸下所產生的特殊物理、化學和生物特性的基礎，加以設計、製作和組裝所需的新材料或新系統，現已應用於不同領域的技藝上，如: 利用奈米顆粒的研究，廣泛地應用於基因治療、藥物遞送、影像醫學及藥物標靶的技術。然而，我們多在問，奈米顆粒究竟看不看的到，當奈米顆粒承載藥物來接觸細胞時，要如何知道奈米顆粒真的可以把藥物帶到細胞中，甚至進入細胞核內，為一直相當受到討論的。為達到可結合影像學觀察與奈米顆粒學技術的目標，整合分子專一標的抗體或光學探針技術，應用在細胞追蹤和醫學影像的追蹤與治療目標，對現代和未來將是一直受到觀察的。針對上述目標，如何尋找一可靠的技術與相互連貫性儀器設備，去了解當奈米顆粒承載藥物後來接觸細胞時，其在細胞內實際狀況和細微變化是必須被定性和定量的應用研究。
在一般螢光顯微鏡下所觀察的細胞影像或螢光表現，都只有來自聚焦面及非聚焦面的光，只可提供的解析較差的影像品質或呈現螢光影像雜質情況，更無法一層一層的深入樣品作觀察，為一般螢光顯微鏡觀察的瓶頸。校內研發處已購入雷射共軛焦顯微鏡 (Confocal Microscope Detection System, Leica TCS SP2)，此儀器共具有螢光顯微鏡目鏡: 10X；物鏡: 10X、20X、40X (air)、63X (oil) 和 63X (water) 及不同雷射光源: UV Laser (激發波長 351 nm)、Ar Laser (激發波長 488 nm)、He-Ne Laser (激發波長 543 nm) 和 He-Ne Laser (激發波長 633 nm) 的四種波長，置放於立夫教學大樓7F研發處貴重儀器室供校內同仁使用。該系統利用雷射光源可提供單一波長和能量均一性特性，通過光學針孔光圈可蒐集來自樣品聚焦面的光所行成影像，將排除非同一聚焦面的光於光學光圈外所形成的共軛焦點影像呈現。同時在雷射光束更具備固定相位特性，使雷射光束聚焦於一小點，做為有效的顯微掃描光源，更屏除一般顯微鏡所造成的影像解析度差 和螢光影像相互干擾問題，透過此種影像技術，提供出更高的光學解析和更佳的觀察細胞影像的解析度。
雷射共軛焦顯微鏡更可根據不同深度的樣品，配合鏡頭和軟體可自動調整焦距技術，已可更達到同樣的清晰觀察效果，使用人員也可任意依照樣品的厚度，指定樣品的上下點位置，設定每一光學切片的厚度，做連續的光學斷層掃描，再藉由雷射激發多重染色的細胞檢體，在掃描器及軟體支援下，做不同深度與連續性時間之影像掃描分析，能了解細胞三維立體狀況及作用時間分布之差異性，並可精確的找出細胞內各項分子物質的傳遞過程與細胞內微組織的功能。更可在固定樣品或活細胞樣品上，使用更高解析的多重螢光染劑標定的螢光影像，從不同的取樣螢光參數和細胞深度參數，來做靜態與動態的觀察紀錄。最後將所得到多重影像觀察資料，從軟體支援下將所得影像資料以重組成立體影像，為可呈現出連續式的立體影像放映，達到各種角度的旋轉或切面觀察，因此，雷射共軛焦顯微鏡已是近年來研究細胞動力學的一項新利器。
目前我們實驗室和本系徐媛曼老師和醫學系賴志河老師共同合作研究下，已用螢光標誌物分別接枝在正電荷生物高分子(幾丁聚醣)和負電荷高分子(肝素)，將上述兩者帶有不同螢光標誌物的高分子，利用離子鍵結反應方式來形成螢光奈米載體，將此螢光奈米載體進行細胞標的，並使用螢光物質 (DAPI) 在進行細胞核染色，藉由校內的雷射共軛焦顯微鏡和物鏡 63X (water) 鏡頭觀察細胞得知，所製備出的螢光奈米載體已可有效進入細胞內，更可被胞飲入細胞核中，此研究結果發表在國際期刊 Biomaterials (2009 年)。進一步，我們為了更加了解當利用奈米載體攜帶藥物後，奈米載體真的可以幫助並提高所需藥物進到細胞裡的機會嗎? 我們再度利用螢光標誌接枝方式，將所使用的藥物(抗生素；amoxicillin) 標誌上綠色螢光物質，用奈米載體來包覆抗生素的製備技術，形成帶有螢光抗生素的奈米載體，進入細胞吞噬實驗測試，更使用校內雷射共軛焦顯微鏡之不同激發波長為: 351 nm (UV Laser)、488 nm (Ar Laser) 和 543 nm (He-Ne Laser) 和結合三維立體重組下，分別觀察到奈米載體和藥物可同時進入細胞和呈現螢光表現，同時帶有螢光的幾丁聚醣在不同細胞深度皆有螢光表現，此研究結果發表在國際期刊 (2010 年)，其它相關研究結果正陸續撰稿中。已發表之相關期刊報告如相關圖片所示 :
【相關圖片】
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