胺機酸分析 後中醫系 林瑋德 助理教授
胺基酸為生物體中重要的成分之一，其為構成蛋白質的基本單位，依照排列特性賦予蛋白質特定的分子結構形態，使它的分子具有生化活性。蛋白質除了是生物體內重要的活性分子，例如催化各種代謝反應的酵素，也可以形成組織器官的架構。游離態的胺基酸廣泛分布在生物體的體液中，例如血液、尿液、果汁、葡萄酒等。部分的植物與微生物可以利用一些基本物質合成出二十種構成蛋白質的胺基酸。大部分的動物則無法合成所有的胺基酸，因此必須藉由攝食來獲得不足的部分。胺基酸除了合成蛋白質外，不同種類的胺基酸還可以藉由生化反應互相轉換或是合成其它物質，例如：phenylalanine藉由phenylalanine hydroxylase的催化可以轉換成tyrosine；tyrosine可以合成dopamine、epinephrine或norepinephrine等神經傳導物質。
雖然胺基酸很重要，然而在生物體內還是要維持在適當的濃度範圍。因此，胺基酸除了可以生合成其它物質外，也可以經由去氨作用變成有機酸類，再經過一系列反應逐步降解為acetyl-CoA、a-ketoglutarate等分子，而能進入TCA循環，藉以產生能量。因此如果負責胺基酸轉換或是分解過程的酵素發生突變造成功能缺失，就會導致其上游的胺基酸或是中間產物(有機酸)大量堆積，進而危害個體的生存。
在研究蛋白質的組成、食品工業、飼料業及醫學健康等方面，分析各種胺基酸的含量是一件相當重要的事情。目前要分析樣品中胺基酸的含量，最常用的方法是以HPLC配合吸光或螢光光譜儀進行。如果使用離子交換樹脂管柱，則在層析分離後與ninhydrin、 fluorescamine、或是o-phthalaldehyde (OPA)進行衍生化反應，再導入螢光或分光光度計中，依據衍生化後的官能基之特定吸光波長加以偵測。另外一種方法則是先進行衍生化反應然後再以reverse phase管柱層析分離，同樣利用所接上的特殊螢光發射基團，以螢光光度計加以偵測。這種方法所使用的衍生化試劑包括：dansyl、phenylisothiocyanate (PITC)、9-fluorenylmethyl chloroformate (Fmoc), 以及 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimyl carbamate (AQC)等。胺基酸經由這些特殊化合物衍生後，如果以UV光偵測靈敏度大約是在pmol；若是以螢光法偵測靈敏度可以到達fmol等級。表1將常用的衍生化試劑做一個整理比較。由於大部分氨基酸在UV到可見光波段間沒有明顯的吸收波長，因此需要藉助前面所提到的各種衍生化試劑反應結合後，增加可偵測性。然而進行衍生化與管柱層析，往往需要花費極長的時間，而且衍生後的特殊吸光或螢光發射基團的穩定性差異頗大，因此要進行氨基酸分析一直都是一件相當繁複的工作，無法做大量的分析使用。
1993年Chace等人發表將胺基酸與正丁醇進行酯化反應，然後以MS/MS進行分析，發現這些衍生後的胺基酸會以固定斷裂一個分子量相同但是不帶電的片段方式，產生子離子。這個模式就是先前提到中性丟失(Nloss)掃描模式，大部分經衍生化的胺基酸都會掉一個102的片段(圖1)。之後經過多方的研究改進，目前主要的20種胺基酸中，除了asparagine與glutamine外，其餘的皆可以利用四種Nloss掃描在很短的時間完成測定。
無論是將樣品完全水解或是僅僅量測游離態的胺基酸，在學術研究及產業應用都具有極大的價值。數十年來，研究人員不斷的想要找尋簡便又快速的方法，希望能滿足分析工作者的需求。在本研究中所使用的丁醇酯化搭配LC-MS/MS直接進樣，應該是目前已知的方法中，唯一能夠達到高速檢測(high throughput)目的的技術。經過將近二十年的時間，這個方法已經成功的應用在臨床醫學的篩檢工作上。
雖然以直接進樣方式用LC-MS/MS分析胺基酸具有快速便利的優勢，但是仍然有一些問題需要考慮改進。(i)由於質譜是基於質量-電荷比的關係加以辨識分子，因此對於同分異構物的鑑別能力就會受到影響，若分子結構差異太小，縱使經過斷裂分析易很難區別，例如胺基酸中的leucine及isoleucine。(ii)直接進樣分析的樣品中如果含有非揮發性鹽類，就會抑制離子化的效果，因此必須經過前處理，例如使用的MeOH萃取，這會遇到增加時間與萃取效率的問題。(iii)丁醇酯化反應可以增加質譜偵測的靈敏度，但是強酸反應環境會使得glutamine與asparagine變成glutamate及aspartate，另外也有報導指出對於含硫的胺基酸，這樣的衍生法在定量上變異很大。(iv)由於要經過萃取及衍生化反應，而這些步驟的效率不可能達到100%，因此必須添加穩定同位素標定的分子作為內標準品，才能在最後有定量的依據。目前關於這些問題的解決方案，幾乎都是使用管柱層析或是毛細管電泳法，但是一旦加上管柱或毛細管，所有樣品的分析時間都要增加到10分鐘以上，而且毛細管或管柱的壽命還會受到進樣樣品的純度影響，若是雜質太多，解析能力很快就會衰減。因此現階段這個經萃取-衍生化的方法，仍然是最快而經濟的。另一方面，有機酸與脂肪酸在水溶液中會帶負電，但是以LC-MS/MS的負電模式分析幾乎沒有帶電的子離子，因此必須要經過衍生化才可加以分析或是以GC-MS來進行分析。未來研究的方向可以朝不需衍生化、縮短層析去鹽的時間等方面進行。
表1. 利用HPLC分析胺基酸時所使用不同的衍生化試劑之比較
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Ninhydrin
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OPA
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OPA
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PITC
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Fmoc
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AQC
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Derivatization typea
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postc
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postc
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prec
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prec
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prec
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prec
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Detection modeb
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c
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f
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f
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UV
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f
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f
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Sensitivity
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pmol
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fmol
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fmol
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pmol
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fmol
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fmol
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Chromatographyc
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i.e.
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i.e.
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r.p.
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r.p.
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r.p.
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r.p.
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OPA, orthophthalaldehyde; PITC, phenylisothiocyanate; Fmoc, 9-fluorenylmethyl chloroformate; AQC, 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate.
a postc, postcolumn; prec, precolumn.
b c, colorimetry; f, fluorescence; UV, ultraviolet.
c i.e, ion exchange; r.p., reversed-phase HPLC.
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