流式細胞技術入門

1. 概覽

流式細胞術是一項快速檢測分析單個粒子多物理特性的技術，通常指細胞通過雷射光束時在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是內部結構，以及相對的螢光強度。通過光電系統記錄細胞的散射光信號和螢光信號可得知細胞特性。

流式細胞儀主要由三部分組成：流動室和液流系統；光路系統以及電子系統。其作用如下：

• 液流系統：依次傳送待測樣本中的細胞到雷射照射區。
• 光路系統：細胞由雷射激發，通過光學濾片產生光信號，並傳送到相應的探測器。
• 電子系統：把光信號轉換為電子信號。對於有分選裝置的儀器，電子系統可初始化分選條件。

在流式細胞儀中，細胞被傳送到液流中的雷射照射區。任何存在於懸液中的直徑為0.2~150微米的粒子或細胞都適用於流式分析。在實際工作中，用實體組織進行流式細胞分析往往是不可能的，分析之前必須對其進行分解。被液滴包繞的粒子稱為細胞液柱，當粒子經過雷射照射區時，通過雷射激發產生散射光。含有螢光的粒子就會表現出其螢光特性。散射光和螢光由光路系統（相應的透鏡，濾片和探測器）收集。分光器和濾光片引導散射光和螢光至相應的探測器，把光信號轉換為電子信號。單個粒子通過其表現出的光散射和螢光屬性，通過列表模式（List mode）完成資料獲取，並對樣本中的細胞亞群進行分析。

 
圖1-1 散射光和激發光信號轉換成為電腦可處理的充電脈衝

2. 液流系統

液流系統的作用是依次傳送待測樣本中的細胞到雷射照射區，其理想狀態是把細胞傳送到雷射光束的中心。而且在特定時間內，應該只有一個細胞或粒子通過雷射光束。因此，必須在流動室內把細胞注入鞘液流。流動室是液流系統的核心部件，臺式機中流動室稱為樣品槽，大型機稱之為噴嘴。在流動室內細胞液柱聚焦於鞘液中心，細胞在此與雷射相交。

流動室內充滿鞘液，根據層流原理，在鞘液的約束下，細胞排成單列出流動室噴嘴口，並被鞘液包繞形成細胞液柱。這種同軸流動的設計，使得樣品流和鞘液流形成的流束始終保持著一種分層鞘流的狀態，這個過程稱為流體聚焦。該原理適用於所有流動室，如圖2-1和2-2所示：

圖2-1 細胞液柱通過樣品槽產生流體聚焦，圖2-2 細胞液柱通過噴嘴產生流體聚焦

樣本壓力和鞘液壓力是不同的，且樣本壓力總是大於鞘液壓力。樣本壓力調節器通過改變樣本壓力的方法控制樣本流速。

• 臺式機：單個細胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出，粒子或細胞在流動室內與雷射相交（圖2-1）。除BD LSR型臺式機有樣本壓力細調旋鈕外，大多數臺式機都採用固定的樣本壓力（分低，中，高速）。
• 大型機：單個細胞懸液從噴嘴噴出後，粒子或細胞在流動室外與雷射相交（圖2-2）。且樣本壓力連續可調。

增加樣本壓力就是通過加寬液柱的方法增加樣本流速。換言之，在特定時間內，允許更多細胞通過液流。當液柱變寬時，一些流經雷射光束的細胞會偏離中心，光斑也會偏離理想角度，這在一定程度下是允許的。

• 高流速適用於定性測量，如免疫表型。樣本流變寬，細胞間距離縮短，這樣在單位時間內流經雷射照射區的細胞數量增加，可以快速獲取資料。
• 低流速促使樣本流變窄，單個細胞得以依次通過，這樣大多數細胞可流經雷射光束的中心，細胞受雷射照射的能量比較均一，因而低流速適用於檢測解析度要求高的實驗，如DNA分析。

為確保粒子和細胞完全通過雷射光束，正確調節樣本壓力對實驗操作是至關重要的。

3. 散射光信號和螢光信號的檢測

上一章我們瞭解到粒子或細胞是如何依次通過液柱的，本節我們首先學習雷射如何照射在單個細胞上的。

3.1 散射光信號

 粒子折射雷射產生散射光信號。散射光不依賴任何細胞樣品的製備技術（如染色），因此被稱為細胞的物理特性，即細胞的大小和內部結構。散射光與細胞膜，核膜以及細胞結構的折射性、顆粒性密切相關，細胞形狀和表面形貌也對其產生影響。

• 前向角散射：前向角散射（FSC）光與被測細胞的大小和面積有關，檢測的是雷射光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向的散射光信號（見圖3-1）。FSC不受細胞螢光染色的影響，常用於免疫表型分析的信號處理。
• 側向角散射：側向角散射（SSC）光與被測細胞的顆粒密度和內部結構有關，對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感（見圖3-1）。SSC收集與雷射光束正交90度方向的散射光信號。

圖3-1 細胞的光散射特性

上述兩種信號都是來自于雷射原光束，目前採用這兩個參數組合，可區分不同種類的細胞亞群，同時可獲得細胞相關的重要資訊，下圖（圖3-2）為FSC和SSC組成的二維散點圖，從圖中可以很容易把全血樣本中淋巴細胞、單核細胞及粒細胞區分開。

 圖3-2 FSC、SSC二維散點圖

3.2 螢光信號

螢光物質吸收符合其波長範圍的光能量，內部電子受激上升到高能級。然後受激電子迅速衰落回基態，釋放過剩能量成為光子。這種能量的轉換稱為螢光。能夠激發螢光物質的波長範圍稱為激發光譜。因為更多的能量消耗在吸收轉換而不是螢光轉換中，所以發射光波長要高於激發光波長。螢光物質的發射波長範圍叫做發射光譜。

目前的流式細胞儀大多採用氬離子雷射器，因為488nm的雷射器能夠激發一種以上的螢光（詳見第7章）。光源的譜線愈接近被激發物質的激發光譜的峰值，所產生的螢光信號愈強。FITC的激發光譜如圖3-3所示，488nm非常接近FITC的激發光譜的峰值，所以FITC被激發時會表現出最強螢光信號，而當FITC被其波譜範圍內的其他波長激發時，也會檢測到螢光，但信號強度不會這麼高。

圖3-3 FITC、PE、PerCP、APC染料的激發光譜
圖3-4 FITC、PE、PerCP、APC染料的發射光譜

如果激發光波長都是488nm，而發射光波長又不是極其接近的話，我們可以同時檢測兩種以上的螢光。如FITC和PE雙染就符合這種條件。這兩種螢光素的發射光譜如圖3-4所示。雖然PE的激發光譜的峰值不是488nm，但也足以檢測到螢光。更重要的是，FITC的發射光波長是530nm，PE的發射光波長是570nm。他們的發射光波長足夠遠，可以使用不同的檢測器。被檢測到的螢光信號數量與粒子中標記上的分子數量成正比。

對單克隆抗體進行螢光染色，通過分析細胞表面抗原標記確認細胞類型（見圖3-5）。在細胞的混合群體中，我們使用不同的螢光染料區分細胞亞群。每個亞群的染色模式與FSC和SSC資料相結合，用於識別樣本中的細胞種類，並可以得到各細胞亞群的百分含量。而且，還可以對感興趣的細胞進行再分選。

圖3-5 螢光標記抗體對細胞表面抗原的特異性結合

4. 光學系統

光學系統由光學激發器和光學收集器組成。光學激發器包括雷射和透鏡，透鏡用於形成雷射光束，並使之聚焦。光學收集器則由若干透鏡組成，用於收集粒子發射的光束---雷射光束相互作用，透鏡組和濾片發送雷射光束至相應的光學探測器。光學平臺的設計可實現以上功能。

4.1 光學平臺

流式細胞儀的光學平臺提供了一個固定平面，將雷射源、光學激發器和收集器控制在一個固定的位置。因而臺式機的流動室和光路是固定的，能夠保證光斑和樣本流自始至終保持恒定。圖4-1、圖4-2、圖4-3和圖4-4分別為臺式機FACSCalibur、FACSCanto、FACSArray和BD LSR II 的光學平臺系統。

圖4-1 臺式機FACSCalibur 光學平臺

圖4-2 臺式機BD FACSCanto 光學平臺

圖4-3 臺式機BD FACSArray 光學平臺

在大型機中，當液流流過噴嘴時，雷射光束通過消色差透鏡組以最佳角度和位置截取液流。由於光斑和液流位置會發生變化，所以大型機的光路沒有臺式機穩定，需要每日優化。光路不正有可能導致粒子受雷射照射的能量不均一，從而被激發出的螢光強度也不相同，造成測量誤差。大型機的光學平臺系統見圖4-5。

圖4-5 大型機FACS Vantage SE 光學平臺

5. 結語

隨著時日演進，流式細胞技術不僅適用於對目標細胞的多重參數分析，包含細胞定性分析(表面抗原、訊息傳導物質的活化分析…)及功能性分析(鈣離子溶度、細胞凋亡、氧化壓力…)；同時，流式細胞技術也可應用在同時定量溶液中多種蛋白質濃度，例如：Cytokine profiling、Phosphorylated kinase profiling…；對於流式細胞儀的原理簡介及使用教學，美商必帝公司提供完整系統來協助您的實驗順利進行；同時，我們也有完整的實驗流程及經驗，可以協助您完成上述以流式細胞儀所進行的實驗。(資料來源：美商必帝公司)

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